Hikaye, Ezio Auditore da Firenze'in Macaristan'da yaşadığı olaylarla başlar. Ezio, ilk olarak Vatikan'daki bir gizli İlkeler cihazını aramak için Roma'ya gelirken, Roma'yı yöneten Templarlar tarafından ele geçirilir ve ailesinin ölümüne neden olan Cesare Borgia tarafından yakalanır. Fakat Cesare, Vatikan'daki gizli İlkeler'i bulamaz.
Ezio, gizli İlkeleri korumak için savaşan bir grup suikastçı olan "Assassin Brotherhood" adlı bir örgütün lideri olan Machiavelli tarafından kurtarılır. Ezio, Roma'yı Templar etkisinden kurtarmak ve Cesare Borgia'yı durdurmak için Assassin Brotherhood'a katılır. Bu süreçte, Roma'daki denetimi ele geçirir ve şehirdeki önemli yerleri geri alır.
Oyunun ilerleyen bölümlerinde, Ezio, Cesare Borgia'nın güçlenmeye devam etmesiyle mücadele eder ve Cesare'nin kardeşi Lucrezia Borgia'nın da dahil olduğu bir dizi önemli karakterle etkileşimde bulunur. Ezio ayrıca Altair'ın Gizli İlkeler cihazının parçalarını bulur ve Templarların elinden korumaya çalışır.
Hikaye boyunca, Ezio, Roma'yı özgürlüğüne kavuşturmak ve Templarların elinden gizli İlkeleri korumak için çeşitli görevler üstlenir. Bu görevler arasında Templar liderleriyle çatışmalar, suikastlar, gizli İlkeler cihazının sırlarını çözmeye yönelik araştırmalar ve Assassin Brotherhood'un gücünü artırmak için Roma'yı restore etme gibi görevler bulunur.
Sonunda, Ezio ve Assassin Brotherhood, Cesare Borgia'nın Roma'da yenilgiye uğraması ve gizli İlkelerin güvenli bir şekilde korunmasıyla sonuçlanan büyük bir çatışmada Cesare'ye karşı savaşır. Hikaye, Ezio'nun Cesare Borgia'yı yakalayıp tutuklaması ve Roma'yı özgür bırakmasının ardından sona erer.
Assassin's Creed Brotherhood, Ezio Auditore da Firenze'in Roma'daki mücadelesini ve Templarlarla olan çatışmasını anlatan zengin bir hikaye sunar.