Oyun, New York City'de geçer. Peter Parker, üniversite öğrencisi ve aynı zamanda örümcek ısırığı sonucu elde ettiği özel yeteneklere sahip biridir. Peter, günlük yaşamında öğrencilik, iş ve kişisel hayatını dengelemeye çalışırken aynı zamanda suçla mücadele eden gizli kimliği Spider-Man olarak da aktif rol oynar.
Hikaye, Martin Li adlı bir hayırseverin New York City'de bir sığınak ve rehabilitasyon merkezi kurma çabalarıyla başlar. Ancak, bir patlamada kimyasal sızıntıya maruz kalan Li, "Bay Negative" adını alarak şiddet dolu bir ikinci kişiliğe sahip olur. Bu ikinci kişilik, düşmanlarına karşı karanlık ve öfke dolu bir güçle savaşırken, Li'nin insanlar arasında saygın imajını korumasını sağlar.
Oyunun ana kötü karakteri olan Wilson Fisk, yani Kingpin, Spider-Man'e karşı bir tehdit oluşturur. Fisk'in çökertilmesi, New York'taki suç dünyasının dengesini bozar ve daha fazla kötü karakterin ortaya çıkmasına neden olur. Oyun ilerledikçe, Peter'ın eski arkadaşı Harry Osborn'un hastalığı ve Osborn ailesinin sırları da hikayeye dahil olur.
Peter, aynı zamanda Mary Jane Watson ile ilişkisini sürdürmeye çalışır ve Mary Jane, oyunun ilerleyen bölümlerinde oynanabilir bir karakter olarak karşımıza çıkar. Oyuncular, Mary Jane olarak oynayarak olayları farklı bir perspektiften deneyimleme fırsatına sahip olurlar.
Hikaye ilerledikçe, Peter'ın geçmişiyle bağlantılı olarak Bay Negative'in planlarının daha büyük ve tehlikeli boyutlara ulaştığı ortaya çıkar. Spider-Man, Bay Negative'in yanı sıra diğer kötü karakterlerle de mücadele eder, özellikle de Dr. Octavius (Doc Ock) olarak da bilinen Otto Octavius ile ilişkisi karmaşık bir hal alır.
Oyunun son bölümlerinde, Peter'ın özel hayatı, suçla mücadelesi ve kahramanlık kimliği arasındaki denge tehlikeye girer. Hikaye duygusal ve aksiyon dolu anlarla sona ererken, Spider-Man'in gerçek gücünün insanlığının bir parçası olduğu vurgulanır.
Marvel's Spider-Man, Spider-Man'in klasik hikayelerinden esinlenerek oluşturulan zengin bir hikaye sunar. Oyun, aksiyon dolu oynanış mekaniğiyle birleşen derin karakter gelişimi ve duygusal anlatımıyla tanınır.