Modern zamanlarda, Desmond Miles isimli bir adam, Abstergo Industries adlı bir şirket tarafından kaçırılır. Abstergo, Desmond'ın atalarının hafızalarını izleyebilen bir cihaz olan Animus'u kullanarak tarihi olayları inceleyerek bir tür antik güç olan "Yaratıcılar"ın (Isu) mirasını aramaktadır.
Desmond'ın atalarından biri, 1191 yılında Kudüs'te geçen olaylara karışan bir suikastçı olan Altair Ibn-La'Ahad'dır. Altair, Kutsal Topraklar'da Templarlar olarak bilinen bir örgüt ile savaşan bir suikastçıdır. Ancak bir görevi başarısızlıkla sonuçlanır ve Altair, suikastçı loncasının lideri olan Al Mualim tarafından cezalandırılır.
Al Mualim, Altair'a gerçek suikastçı prensiplerini yeniden öğretmek ve 9 önemli şahsiyeti öldürerek onarabilirse, itibarını geri kazanabileceğini söyler. Bu kişiler, Kutsal Topraklar'ın dengesini bozan ve Orta Doğu'yu savaşa sürükleyen Templar liderleri tarafından kontrol edilen figürlerdir.
Oyun ilerledikçe, Altair, hayatını ve suikastçıların gerçek amacını sorgular. Sonunda, Altair ve oyuncu, Yaratıcılar'ın (Isu) varlığının ve onların insan ırkını nasıl şekillendirdiğinin farkına varır.
Modern zamanlarda, Desmond, Abstergo'nun Templar hedeflerini öğrenir ve bu bilgileri suikastçı loncasına iletmek için Animus'u kullanarak Altair'ın hafızalarını izler.
Oyun, Altair'ın hikayesinin yanı sıra modern zamanlardaki Desmond'ın yaşadıklarını birleştirir. Oyun serisinin devamında, bu iki zaman çizgisi daha da geliştirilir ve genişletilir.